产品目录

本试剂盒是以分子流行病学最新研究进展为基础，经工艺优化后形成的人型结核分枝杆菌基因分型产品。本制品利用结核分枝杆菌基因组中可变数目串联重复序列（variable-number tandem repeats,VNTR）多态性进行基因型分型区分临床菌株，是研究结核分枝杆菌分子流行病学和监测结核病传播状况的有力工具。与现有其它基于VNTR原理的结核分枝杆菌VNTR分型系统相比，这一分型系统对中国流行的菌株具有更强的分辨能力，因此特别适合于中国用户的需求。

通过对各PCR反应引物序列和预混反应液成份进行精心优化，使得本制品具有很强的抗干扰力。与用户自配试剂相比，本制品显著提升了特异条带信号强度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）时非特异条带的出现率，使实验操作更加简便、快捷的同时，提高了检测成功率。本制品的预混反应液化学稳定性良好，能有效抵抗反复冻融（10次）和较长时间（一周）的室温环境，更好地适应了用户检测工作中的灵活性需求。

本试剂盒是结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)(货号：WE0118)的配套产品。对VNTR-9试剂盒鉴定为成簇或相同菌株的样本，如有必要，可使用本制品做更精细的进一步分型鉴定。本制品中的3个高分辨率检测位点VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232与VNTR-9中的9个检测位点结合使用可将检测的分辨率指数（Hunter-Gaston index，HGI)提升至0.993。

• 本制品是结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)(货号：WE0118)的配套产品。待测菌株应先经过VNTR-9分型检测，再使用本制品检测。且本制品的检测结果应与VNTR-9的检测结果进行整合分析。
  
• 为避免污染，建议制备生物时与配制PCR Mix在不同的地点内进行，并使用不同的移液器。
  
• 在样本DNA的收集，抽提和扩增的所有环节都应注意作好标记，同时防止不同样本间发生交叉污染。
  
• 常用试剂和耗材在实验前需高压灭菌。
  
• 每管PCR Mix中均含有不同的引物，不可混用。可根据实验需求一次性分装为不同的量，避免反复冻融。
  
• 为避免打开反应管时，反应液飞溅，开盖前请短暂离心，收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用75%酒精或稀酸擦拭桌面。
  
• 吸取时注意不要交叉污染PCR Mix，建议每次取Mix前用75%酒精擦拭移液器头2次。
  
• 实验前准备：1×TE缓冲液（PH=8.0）、0.5×TBE缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、普通PCR仪、DNA电泳设备和凝胶成像仪、0.2mL PCR反应管、八联排或96孔PCR管、不同规格的移液器：0.5～10μL和20～200μL。

• DNA模板制备：
  
  • 从固体培养基上刮取少量(1-2接种环)样本，重悬于100μL TE中，80℃灭活30分钟。
    
  • 灭活后的菌株拿出P3实验室进行如下操作：
    100℃煮沸10分钟(煮沸时注意避免EP管盖子爆开，避免让水进入管中)，立即置于冰上2分钟，12000rpm
    (~13400×g)离心10分钟，取上清置于另一无菌EP管中，做上标记，-20℃保存。
• 检测程序：
  
  • 取出TB基因分型试剂盒HV-3，待液体平衡到室温后，轻微摇晃3～4次混匀，然后12000rpm (~13400×g)离心5
    秒，使盖上的液体回落到管内。
    
  • 三位点VNTR分型：对于12位点结果相同的菌株需进一步进行VNTR分型，即增加以下4个位点进行比较。
    
    • PCR扩增：反应体系为20μL。
      在每个PCR管里分别加入19μL VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232的PCR Mix，加入1μL DNA模板，混匀。
      
    • 扩增条件：
      
      • VNTR3820：
        

        步骤	温度	时间	循环数
        预变性	95℃	10min	1
        变性	94℃	30 s	30
        退火	58℃	30 s
        延伸	72℃	90 s
        终延伸	72℃	7min	1

      • VNTR3232、VNTR4120：
        

        步骤	温度	时间	循环数
        预变性	95℃	10min	1
        变性	94℃	30 s	30
        退火	64℃	30 s
        延伸	72℃	90 s
        终延伸	72℃	7min	1

    • 制胶、电泳：
      
      • 重要事项：
        重要！每次实验需要设置阳性（H37Rv菌株DNA）和阴性对照（去离子水）。
        关键！本实验是以琼脂糖凝胶电泳为基础来判读VNTR位点基因型，因此，为了使结果准确，在电泳这一步必须要按照统一的标准操作，应注意以下几点：
        ① 制胶所用梳子为18孔。
        ② 凝胶左右边上的两个孔由于在电泳过程中容易使条带变形，影响结果判读，舍弃不用，或者在其中一个孔点上阴性对照。剩余16孔分为12个样本，3个DNA Marker和1个阳性对照。点样顺序分别为“1，2，M，3，4，5，6，M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，数字代表样本，M代表DNA Marker。
        ③ PCR扩增产物进行首次电泳并使用Marker I时，凝胶浓度为1%，电压为150V，时间为100～120分钟。
        ④ 如果扩增产物片段过大（>1000bp），需要再次电泳并使用Marker II时，凝胶浓度为0.8%，电压150V，时间为150分钟。
        
      • 制胶以及电泳过程：
        使用1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳。
        配制1%的琼脂糖凝胶，12×12cm胶盘制胶，每块胶为80mL。
        ① 称取0.8g琼脂糖，加入80mL 0.5×TBE，在天平上称重后放入微波炉，高火加热2～3分钟，使琼脂糖完全溶化，摇匀，观察为均一透明溶液，无颗粒，再在天平称量，补入适量的双蒸水，以保持胶的浓度不受影响。
        ② 待融化的凝胶冷却至55℃左右时加入4μL溴化乙锭（10μg/mL），轻轻旋转以充分混匀。用18齿的梳子制胶，将温热的凝胶浇灌入12×12cm胶盘。
        ③ 待凝胶完全凝结（室温下放置40分钟），小心拔出梳子，取出托盘，放入电泳槽中。电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，没过胶面1～2mm。
        ④ 上样电泳：每块胶中加入12个样本（最边上的孔不加样），每个孔中加入3～5μL PCR产物，同时每块胶上加三个5μL DNA MarkerⅠ。电压150V，电泳时间为100～120分钟。本步骤是各位点最终读数是否准确的关键，需要统一按照此标准操作。
        ⑤ 部分位点在临床菌株中存在扩增产物大于1000bp的情况，对这些扩增产物再利用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，同时加入DNA Marker II作为条带大小对照，电压150V，电泳时间150分钟。
    • 结果显示：
      
      
    • 结果分析：
      ① 如果不同菌株的3个高变位点基因型也相同，可确定为成簇菌株；
      ② 如果高变位点读数高度相似，即只有1～2个高变位点有差别，需结合流行病学数据鉴定是否为成簇菌株；
      ③ 如果3个高变位点基因型都不一致，鉴定为单一菌株。